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项目 凝胶迁移实验
服务内容 EMSA凝胶迁移实验
服务周期 10-20工作日
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EMSA凝胶迁移实验

原理:

EMSA是检测蛋白与DNA形成复合体并直接相互作用的技术方法,可用于定性和定量分析,能够更准确的判断蛋白与DNA的特异性结合序列,因此蛋白-DNA复合体的识别在研究基因的表达调控中具有重要作用。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素或生物素标记的DNA或RNA探针共孵育,在非变性聚丙酰胺烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

 

实验流程:

1. 样本数(泳道)设定及浓度梯度实验设计;

2. 3'生物素探针设计及合成;

3. EMSA电泳凝胶配置;

4. 电泳分离复合物和非结合的探针;

5. 紫外交联;

6. EMSA反应物电泳检测;

7. 实验分析及报告。

相关要求(客户提供):

1. 细胞核蛋白提取物或纯化的转录因子,部分实验亦可使用重组表达的蛋白,每张膜至少提供50uL,浓度>0.5mg/ml;

2. 探针序列,如需设计,请客户提供DNA结合蛋白相关信息或相关文献。

 

最终结果

1. 实验合成生物素标记探针;

2. 非标记探针(竞争性EMSA);

3. 剩余目的蛋白和抗体;

4. 具体试验流程(包括:实验步骤;主要仪器及试剂说明(含仪器厂家、型号;试剂厂家、批号));

5. 原始实验图片及数据。