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项目 免疫共沉淀
服务内容 免疫共沉淀
服务周期 30-40工作日
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免疫共沉淀

原理:

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白,那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离,对B蛋白进行检测,进而证明两者间的相互作用。

这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

 

实验流程:

1. 收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)裂解细胞;

2. 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将相应的抗体加入到细胞裂解液,摇晃孵育过夜;

3. 取protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次;

4. 将预处理过的protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

5. 免疫沉淀反应后,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入上样缓冲液,沸水煮5分钟;

6. SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白。


相关要求(客户提供):

1. 客户需提供用于裂解的细胞或组织样本;

2. 如需对目的基因进行过表达则需目的基因的序列信息,含有目的基因的质粒,如需PCR克隆则需提供cDNA模板或组织样本;

3. 如要进行特异性IP,客户需提供IP级别的一抗。 

 

最终结果:

1. 构建得到的目的基因过表达质粒;

2. WB检测结果;

3. 具体试验流程(包括:实验步骤;主要仪器及试剂说明(含仪器厂家、型号;试剂厂家、批号));

4. 原始实验图片及数据。