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双分子荧光互补技术(BiFC)

                                           发布于:2018-7-11


一、BiFC技术原理

   荧光蛋白被切成两个肽段后,每个肽段不能被激发发射荧光,也不能自发组装成完整的荧光蛋白从而被激发产生荧光,但是当两个片段分别融合于相互作用的两个蛋白时,在相互作用蛋白的辅助下能重新组建成完整的荧光蛋白,从而被激发产生荧光。

            

二、BiFC选用系统

    本实验室选用Venus双分子荧光互补系统是将绿色荧光蛋白GFP的突变体黄色荧光蛋白Venus从155或173位点切开,用有相互作用的两条碱性亮氨酸拉链短肽bJun和bFos分别融合到切开的Venus蛋白的N端和C端,是一种适用于生理条件的BiFC系统。


三、BiFC操作流程

1、载体构建

2、质粒共转

3、荧光显微镜拍照

   
四、BiFC实验常见问题及解决方法 

1、荧光信号较弱

原因:蛋白空间位阻所导致的片段间不能相互靠近

对策:荧光片段和目标蛋白之间最好加一个连接肽。

常用的连接肽氨基酸序列有RSIAT,RPACKIPNDLKQKVMNH和GGGGS等

2、实验温度不当

原因:温度对片段间互补影响很大

对策1在室温或低于室温(≤)下培养细菌或细胞

对策2在生理条件下培养细菌或细胞,使融合蛋白正常表达,然后将培养物低温处理1至2h或接着室温培养1d

3、不能明确蛋白之间的相互反应

原因:没有明确的阴性对照

对策:建立阴性对照。以便更加确信BiFC信号反映的是蛋白质之间的相互作用

4、转染效率低

原因:所使用DNA的启动子不能被待转染细胞所识别

对策:在转染实验前,请确认所转染DNA确实能在待转染细胞内表达

5、没有生成高效率的DNA-转染试剂复合物

原因:在制备生成DNA-转染试剂复合物时,使用了含有血清的产品

对策:转染复合物必须在无血清中形成

6、细胞毒性大

原因1DNA用量太大

对策1建议绘制量效关系曲线来确定最佳的DNA用量

原因2细胞密度太低

对策2转染DNA时,建议细胞密度控制在~70%左右,细胞密度太低可导致转染过程中细胞毒性增加

原因3稳定转染时抗生素加入时机太早

对策3在转染48h后加入选择用抗生素

7、转染效果不稳定,不能重现

原因:转染时细胞密度没有控制的较为均一,差异太大

对策:务必使每一次转染时细胞的密度较为均一。推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降

8、转染试剂有时呈云雾状浑浊

原因:转染试剂储存温度太低

对策:请务必不要低温保存转染试剂,+4℃环境即可;如果将转染试剂误放在-20℃以下环境,建议将冰冻的转染试剂(LipoD293™和LipoJet™转染试剂除外)温浴10min后,待完全融化后,再进行转染操作。

9、转染复合物出现沉淀

原因:有过量的EDTA存在

对策:将DNA溶于纯水而不是TE缓冲液


五、BiFC技术优缺点

优点:

1、适用于体内和体外蛋白相互作用的研究

2、在细菌,真菌以及真核细胞中检测时,所研究的蛋白处于天然环境中并且能直观报道白相互作用在细胞中的定位研究

3、BiFC技术耗时较短

4、BiFC只需要荧光倒置显微镜,数据处理简单,只是检测荧光的有无,背景干净,检测更加灵敏,不依赖于其他次级效应

5、BiFC技术还可以用于研究蛋白之间的弱相互作用或瞬间相互作用,不需要蛋白有特别的理论配比,能检测到不同亚群蛋白间的相互作用

缺点

1、对系统温度敏感,一般在30℃以下形成互补效应好,温度越低,越有利于片段的互补,这对细胞在生理条件下的蛋白相互作用带来不利因素

2、观察到的双分子荧光信号滞后于蛋白的相互作用过程,不能实时观察,蛋白相互作用或蛋白复合物的形成过程