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RNA m6A甲基化修饰

                                           发布于:2018-9-21

真核生物RNA可以携带100多种化学修饰,其中RNA甲基化修饰约占60%,而N6-甲基腺嘌呤(m6A)在甲基化修饰中最为普遍,占有率高达80%。从2017年至今,RNA m6A研究热度不减,已有7篇在《Nature》、2篇在《Cell》、2篇在《Cancer cell》上发表。


概念

m6A是腺苷酸上第六位N上发生甲基化,主要存在于mRNA的CDS区与3’ UTR区,影响mRNA的稳定性、翻译效率、可变剪切和定位等。此外,LncRNA、microRNA、circle RNA等非编码RNA也存在m6A位点。


分子机制

Fig.1. RNA m6A 甲基化作用机制

mRNA RRACH序列中的腺嘌呤在甲基化酶的作用下,其第6位N上的H被CH3取代发生甲基化,此过程是可逆的;甲基化的mRNA与m6A识别蛋白结合,进而影响细胞核内miRNA初级转录本的加工、miRNA前体的剪切、mRNA的运输及细胞质中mRNA的翻译或降解。


核心分子:

writers:甲基化酶,介导RNA甲基化修饰过程,目前已知的成分有METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429

erasers: 去甲基化酶,有FTO和ALKBH5

readers: m6A结合蛋白,识别并结合mRNA上的m6A位点,有YTH结构域蛋白(YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3)、核不均一蛋白(HNRNPA2B1)和胰岛素样生长因子(IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3)



RNA甲基化的检测方式

Fig.2.MeRIP‐seq

实验步骤:

(1) 提取RNA,用Oligo-DT磁珠对总RNA中带有PolyA的mRNA进行富集;

(2) 加片段化试剂或用超声波仪进行片段化,片段大小约为100nt;

(3) 将片段化的RNA分为2份,一份加入带有m6A抗体的免疫磁珠对含有m6A的mRNA进行富集,另一份作为对照,直接构建常规的转录组测序文库;

(4) 对构建好的两个测序文库,即m6A-seq library和RNA-seq library分别进行高通量测序。

注意事项:

(1)提取的总RNA起始量建议在800μg以上;

(2)对RNA纯度要求较高,所提供的细胞数量在108-109以上;

缺点:分辨率较低,只有100-200nt,只能鉴定高度甲基化的区域。


 

研究思路:

1.查找m6A相关酶在某一肿瘤或疾病中的异常表达情况,可以在cbioportal,oncomine,和GEO datasets数据库中筛选。

2.通过m6A-seq和RNA-seq的结合,寻找m6A含量与RNA分子数量变化较大的mRNA进行进一步的研究。

3.细胞及动物的表型实验。通过敲降或过表达某m6A修饰酶,检测细胞活性、细胞增殖、凋亡、周期、转移等。


研究成果:

1.   m6A修饰影响哺乳动物大脑皮层的神经形成


2.  细胞外信号刺激能调节m6AmRNA甲基化


3.  m6A mRNA甲基化能调节紫外线引起的DNA损伤反应


4.  m6A mRNA甲基化参与T细胞的动态平衡


5. 去甲基化酶FTO在急性髓细胞白血病发挥癌基因的作用


6. lncRNA FOXM1甲基化促进胶质瘤细胞肿瘤的形成